濾紙酶（Filter paper Activity，F(xiàn)PA）試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

濾紙酶試劑盒 糖代謝

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

纖維素酶是由微生物產(chǎn)生的多組分的酶系，能水解纖維素β-1,4 葡萄糖苷鍵生成葡萄糖，研究濾紙酶活力對纖維素酶的研究具有非常重要的意義。

測定原理：

濾紙酶水解濾紙產(chǎn)生的還原糖能與 3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物，在 540nm 處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)液顏色深淺與還原糖的量成正比，可測定計算得濾紙酶的活力。

組成：

自備儀器和用品：

天平、研缽、低溫離心機、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋。

酶液提?。?/span>

組織：按照質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1ml 蒸餾水）加入蒸餾水，冰浴勻漿后于 4℃，12000rpm 離心 10min，取上清置于冰上待測。

細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個）：蒸餾水體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 4℃，12000rpm離心 10min，取上清置于冰上待測。

培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測。

測定操作：

根據(jù)樣本數(shù)量取兩倍數(shù)量的濾紙條和 Ep 管，每支Ep 管中放入一個卷狀濾紙條（注意要放入底部），作為底物。

對照管：取 200μl 滅活的酶液，加入 500μl 試劑一，充分混勻，再加入放有濾紙條的 Ep 管中，標(biāo)注為對照管。

測定管：取 200μl 酶液，加入 500μl 試劑一，充分混勻，再加入放有濾紙條的 Ep 管中，標(biāo)注為測定管。

對照管和測定管同時置于 50℃水浴鍋中反應(yīng) 30min。

加入 800μl 試劑二，沸水浴 5min，自來水冷卻后取 200μl 于微量石英比色皿/96 孔板中測定 540nm 處吸光值，分別記為A 對照管和A 測定管，△A= A 測定管- A 對照管。

酶活性計算公式：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.2805x - 0.0255，R2 = 0.9991

按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在 50℃，pH4.6 條件下，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ Cpr

按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在 50℃，pH4.6 條件下，每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ W

按液體體積計算

酶活性定義：在 50℃，pH4.6 條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/ml）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反總÷V 樣÷T

= 0.891×（△A+0.0255）

按細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義：在 50℃，pH4.6 條件下，每 104 個細(xì)胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/104cell）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量（萬個）÷V 樣總）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬個）

V 反總：反應(yīng)總體積，1.5ml，V 樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.2ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；

Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，30min

用 96 孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.1403x - 0.0255，R2 = 0.9991

按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在 50℃，pH4.6 條件下，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

=1.782×（△A+0.0255）÷ Cpr

按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在 50℃，pH4.6 條件下，每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 1.782×（△A+0.0255）÷ W

按液體體積計算

酶活性定義：在 50℃，pH4.6 條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/ml）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V 反總÷V 樣÷T

= 1.782×（△A+0.0255）

按細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義：在 50℃，pH4.6 條件下，每 104 個細(xì)胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/104cell）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量（萬個）÷V 樣總）÷T

= 1.782×（△A+0.0255）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬個）

V 反總：反應(yīng)總體積，1.5ml，V 樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.2ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；

Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，30min

注意事項：

用干凈的鑷子取出濾紙條，帶手套卷成卷放入Ep 管底部。

樣本滅活時保證同一批樣本處理時間一致，建議沸水浴十分鐘。

批量樣本測定之前先做 1-2 個樣本的預(yù)實驗，若吸光值超過 1.2，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

顯色后取檢測液時注意槍頭不要碰到濾紙條，以免帶入毛狀物，影響測定結(jié)果

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