諾博萊德 高純度質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）核酸提取

HiPure Plasmid Mini Kit高純度質(zhì)粒小量快速提試劑盒

目錄號：31013

高純度質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）核酸提取產(chǎn)品內(nèi)容：

保存條件：

在室溫(15~ 25℃)干燥條件下，可保存12個(gè)月。加入RNaseA后的溶液P1應(yīng)置于 2 ~ 8℃保存，可穩(wěn)定保存6個(gè)月,如果P1中RNase A失活，重新補(bǔ)加即可。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品簡介：

本試劑盒用于高純度質(zhì)粒DNA的小量制備。菌體經(jīng)堿裂解、高鹽、低pH處理，質(zhì)粒可從菌體中釋放出來，并特異、高效地被離心吸附柱吸附。通過清洗液的洗滌可去除雜質(zhì)，在低鹽、高pH條件下洗脫，最后得到純度較高的質(zhì)粒 DNA。所得質(zhì)粒可直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、RT-qPCR、測序及轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.得率高：1.5-4.5ml可提出多達(dá)10–20ug的純凈質(zhì)粒；

2.純度高：沉淀致密，去雜質(zhì)徹di干凈；

3. 高效：操作簡便，快捷，節(jié)約時(shí)間。

注意事項(xiàng)：

1.使用前請先檢查平衡液、溶液P2和溶液P3是否出現(xiàn)渾濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。

2.細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間一般為12~16小時(shí)，過度培養(yǎng)會降低質(zhì)粒質(zhì)量甚至導(dǎo)致質(zhì)粒DNA突變；

3.注意溶液P1，P2和P3的用量比例，若細(xì)菌量增大，需按比例放大這些溶液的使用量；

4.隨菌體增多應(yīng)延長溶液 P2 的作用時(shí)間，直至溶液成粘稠透明狀，但時(shí)間過長會導(dǎo)致質(zhì)粒DNA變性。

5.質(zhì)粒的產(chǎn)量跟細(xì)菌量、質(zhì)?？截悢?shù)、質(zhì)粒大小和操作規(guī)范程度密切相關(guān)，一般1.5ml過夜培養(yǎng)菌體可收獲約10ug高拷貝質(zhì)粒。

重要提示：

一、第一次使用前請先在去蛋白液PE、漂洗液WB中加入指ding量無水乙醇（見瓶身標(biāo)簽），充分混勻，并做好標(biāo)記，以免多次加入。

二、首ci使用時(shí)請先將 RNaseA全部加到溶液P1中，混勻，每次使用后置于2~8℃保存。

操作步驟：

1.  柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入100ul的平衡液，12,000rpm離心1min，棄收集管中濾液，將吸附柱重新放回收集管中。

2.取1~5ml過夜培養(yǎng)的菌液，室溫12,000rpm離心30sec，盡量倒干上清，收集菌體。

（注意：根據(jù)菌液的濃度決定取液量，濃度高時(shí)取1.5ml菌液離心即可，濃度低時(shí)可多收集一次）

3. 加入250ul溶液P1，重懸菌體沉淀，渦旋震蕩至徹di懸浮。

（注意：如有未徹di懸浮的菌塊會影響裂解，導(dǎo)致提取的質(zhì)粒濃度及純度降低）

4. 加入250ul溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，使菌體充分裂解，室溫放置4min。

（注意：不可劇烈震蕩，以免造成基因組 DNA 片段的污染，所用時(shí)間不要超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞，如未完quan變得清亮，可能是菌體太多，可增加溶液P2的用量，在后續(xù)的操作中溶液P3的用量也要相應(yīng)增加）

5.加入350ul溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8 次，充分混勻時(shí)會出現(xiàn)白色絮狀沉淀，然后室溫12,000rpm離心10min。

（注意：加入溶液P3后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生SDS的局部沉淀）

6. 將上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫12,000rpm離心1min，質(zhì)粒被吸附在膜上，棄濾液。

7.可選步驟：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PE，室溫12,000rpm離心1min，棄濾液。

（注意：去蛋白液PE為濃縮液，按要求加入無水乙醇，用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發(fā)）

（注意：如果宿主菌是endA-，如DH5α，此步驟可省略。如果宿主菌是 endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101等，此步驟不可省略，因這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒。如果提取低拷貝質(zhì)粒也推薦采用此步驟）

8. 加入600ul漂洗液 WB，室溫12,000rpm離心30sec，棄濾液。

（注意：漂洗液WB為濃縮液，按要求加入無水乙醇，用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發(fā)）

9. 重復(fù)步驟8一次。

10.   室溫12,000rpm離心2min，甩干殘留液體。

（注意：此步不能省略，否則殘留乙醇會影響質(zhì)粒的后續(xù)使用）

11.  將吸附柱置于一個(gè)新的1.5 ml離心管（自備）中，加入50~100 ul的洗脫緩沖液EB，室溫放置2 min，12,000 rpm離心1 min，離心管底溶液即質(zhì)粒DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中預(yù)熱洗脫緩沖液EB，可增加洗脫效率；如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，再次離心1min 收集；如需使用去離子水洗脫，可用NaOH調(diào)整其pH值在7.0 -8.5之間。）

低拷貝或大質(zhì)粒（>10kb）提取

如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0kb 的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用 5~10ml過夜培養(yǎng)物，同時(shí)按照比例增加溶液P2、P2、P3的用量，脫緩沖液EB應(yīng)在65℃水浴預(yù)熱，在吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)延長時(shí)間，以增加提取效率，其它步驟相同。