諾博萊德 細(xì)菌總RNA提取試劑盒(帶gDNA過(guò)濾器）

FlashPure Plus Bacteria Total RNA Mini Kit細(xì)菌總 RNA 快速提取試劑盒（含 gDNA 過(guò)濾器）

目錄號(hào)：91413

產(chǎn)品內(nèi)容

自備試劑

無(wú)水乙醇

保存條件

rong菌酶，常溫運(yùn)輸， 4℃保存；其他組分，室溫（15 ~ 25℃）保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

FlashPure Bacteria Total RNA Mini Kit 是專用于提取細(xì)菌（G+、G-）的總 RNA，采用高效的 gDNA 過(guò)濾器，不需要繁瑣的 DNase I 消化過(guò)程。得到的 RNA，可直接用于 RT、RT-PCR、RT-qPCR、RACE、測(cè)序、芯片等。

產(chǎn)品特點(diǎn)

1. 無(wú)毒：免氯仿、免β-巰基乙醇！

2. 高質(zhì)：28s/18s=2:1，OD260/280=2.0～2.2！

3. 高效：提取全過(guò)程僅需 10 min！

重要提示：

① 第一次使用前，請(qǐng)先在漂洗液 RW 中加入無(wú)水乙醇，詳見(jiàn)瓶身的標(biāo)簽。

② 每次操作前，請(qǐng)先配制添加了rong菌酶或者 Lysostaphin 的 TE (PH 8.0)，終濃度為 1mg/ml。

③ 所有離心步驟均需要在室溫（15~25℃）下進(jìn)行。

操作步驟：

1. 離心收集 1 ~ 2 ml 菌液（10⁸ ~10⁹細(xì)胞）到一個(gè) 1.5 ml 離心管, 徹di吸棄上清。

2. 根據(jù)細(xì)胞的種類和數(shù)量，充分重懸細(xì)胞在 100 μl (5x10⁸細(xì)胞) / 200 μl

( 5x10⁸~7.5x10⁸ 細(xì)胞 ) TE 中（確保rong菌酶或者 Lysostaphin 已添加至 TE 中，濃度為 1mg/ml )，或者直接用 TE 重懸后，用干凈槍頭挑取少許rong菌酶加入。

3. 室溫(15~25℃)溫育5min/rong菌酶, 或者37℃溫育15min/ Lysostaphin，破解細(xì)胞壁。每 2 min 渦旋振蕩 10 sec，幫助破壁。

注意：各種細(xì)菌破壁的難易程度不一樣，一般革蘭氏陰性菌 E.coli 使用上面的條件就足夠了，,甚至可能省略該步驟，但是某些革蘭氏陽(yáng)性菌如B. subtilis 難破壁需要提高rong菌酶濃度到 15mg/ml 和溫育時(shí)間到10min。如果金黃色葡萄qiou菌需要加入 lysostaphin 到 1mg/ml，37℃溫育 15min。總之不同細(xì)菌類型破壁難易程度不同，有的難破壁的種類需要根據(jù)用戶自己的具體情況調(diào)節(jié)酶的種類、工作濃度和溫育溫度、時(shí)間，此外還可以聯(lián)合使用玻璃珠擊打，機(jī)械破壁，蛋白酶 K 消化等方法幫助破壁。

4. 短暫離心收集細(xì)菌，徹di吸棄上清后，加入 500 μl 裂解液 BRL Plus，渦旋震蕩或者反復(fù)吹打，裂解細(xì)菌。

5. 將裂解勻漿液全部加到 gDNA 過(guò)濾器中（過(guò)濾器放入收集管中），13,000 rpm 離心 1 min，保留濾液，（RNA 在濾液中）。

6. 向?yàn)V液中加入等體積（通常為 500 μl）的 70%乙醇，立即吹打混勻。

7. 每次轉(zhuǎn)移≤750 μl 濾液混合物至 RNA 吸附柱中（吸附柱放入收集管)，13,000 rpm 離心 1 min，倒棄濾液。此時(shí)，RNA 被吸附在膜上，重復(fù)此過(guò)程，直到溶液全部上柱。

8. 加入 700 μl 去蛋白液 RW1,室溫放置 1min,13,000 rpm 離心 30 sec，倒棄濾液。

9. 加入 500 μl 漂洗液 RW，13,000 rpm 離心 30 sec，倒棄濾液。

10. 重復(fù)步驟 7。

11. 把 RNA 吸附柱放回收集管中，13,000 rpm 離心 2 min，徹di除去膜上的乙醇。

12. 取出 RNA 吸附柱，放入新的 RNase-free 1.5 ml 離心管中，向吸附膜的中央部位懸空滴加 30-50μl RNase-Free H2O（事先在 70-90℃水浴中加熱可提高產(chǎn)量），室溫放置 1 min，13,000 rpm 離心 1 min。

13. 得到的 RNA，可直接用于下游實(shí)驗(yàn)，或于-70℃保存，以免降解。

附錄：

一、免液氮直接研磨（自動(dòng)研磨儀）——適用于新鮮樣本

a. 在 2.0 ml 液氮研磨管中加入 4 mm 兩粒，加 600 μl 裂解液 ARL plus，放進(jìn) 20 mg 左右的樣本，設(shè)置 65 個(gè)頻率，震蕩 2 min。

b. 將裂解物 13,000 rpm 離心 3 min，沉淀不能裂解的碎片。

二、液氮研磨（自動(dòng)研磨儀）:

a. 把研磨模塊丟到液氮中預(yù)冷，直到?jīng)]有氣泡冒出視為預(yù)冷完畢。

b. 在 2.0 ml 液氮研磨管中放入 3mm 鋼珠 3 粒，放進(jìn) 20-30mg 樣本，

投入液氮中預(yù)冷。

c. 把預(yù)冷好的離心管插入研磨模塊中，放進(jìn)研磨儀，設(shè)置 55 個(gè)頻率，震蕩 30~60 sec。（以北京赫得研磨儀——京 N9548 為例）

d. 研磨完成后，馬上加 600 μl 裂解液 ARL Plus，劇烈渦旋振蕩,充分混勻。

e. 將裂解物 13,000 rpm 離心 3 min，沉淀不能裂解的碎片。

相關(guān)產(chǎn)品：

71118-100 Script III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（for PCR or qPCR）

71710-100 Script III All-in-one RT Mix with dsDNase（for qPCR）

71600-500 2x Universal SYBR Green qPCR Mix (適用于所有qPCR儀)

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