糖原合成酶（Glycogen synthase，GCS）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

糖原合成酶試劑盒 糖原系列

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

GCS（EC 2.4.1.11）催化 UDPG 和葡萄糖殘基生成糖原和 UTP，以α-1，4-糖苷鍵相連延長(zhǎng)糖鏈，是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶，是胰島素作用的主要靶酶，對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)和血糖穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用。

測(cè)定原理：

GCS 催化UDPG 和葡萄糖殘基生成糖原和UDP，丙tong酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化 NADH 氧化生成NAD⁺，在 340nm 下測(cè)定NADH 下降速率，即可反映 GCS 活性。

組成：

自備儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：臨用前將試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、試劑五的配制：臨用前在試劑五中加入 1ml 試劑二充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

4、將工作液和試劑五置于 37℃預(yù)熱 5 分鐘。

5、在 1ml 微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、10μl 試劑五和 180μl 工作液，立即混勻，記錄 340nm處初始吸光值A(chǔ)1 和 1min 后的吸光值 A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意：在該試劑盒中，若ΔA 大于 0.1，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定，使ΔA 小于 0.1 可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

GCS 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GCS（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=3215×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GCS（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=6430×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.01ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

糖原合成酶試劑盒 糖原系列