線粒體復合體Ⅴ試劑盒說明書

分光光度法 25 管/12 樣

線粒體復合體Ⅴ試劑盒 氧化磷酸化

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

線粒體復合體Ⅴ又稱F1F0-ATP 合酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，由F1和F0 兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學梯度催化 ATP 合成，也可逆過程水解ATP。此外，復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP 的關(guān)鍵酶。

測定原理：

復合體Ⅴ水解ATP 產(chǎn)生ADP 和Pi，通過測定Pi 增加速率來測定復合體Ⅴ活性。

試劑的組成和配制

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前每支加入 1.3mL 蒸餾水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 3mL 蒸餾水，充分混勻；溶解后 4℃保存一周；試劑七：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10mL 蒸餾水，充分混勻；溶解后 4℃保存一周；試劑八：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10mL 蒸餾水，充分混勻；溶解后 4℃保存一周；

定磷試劑的配制：按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染（請根據(jù)需要，用多少配多少）。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細菌或細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅴ（此步可選做）。

5、步驟 4 中的沉淀即為線粒體，加入 800uL 試劑二和 8uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或

200W，超聲 3s，間隔 10 秒，重復 30 次），用于復合體Ⅴ酶活性測定。

測定步驟：

1、酶促反應(yīng)

混勻， 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）準確水浴 30min

混勻，4000g，25℃離心 10min，取上清液

2、定磷

混勻，室溫靜置 10min 左右，在 660nm 處讀取A 測定管和A 對照管，計算ΔA=A 測定管-A 對照管。

復合體Ⅴ活性計算

標準條件下測定的回歸方程為y = 1.274x + 0.004；x 為標準品濃度（mmol/L），y 為A 值。

1、組織中復合體Ⅴ活性的計算:

按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。 復合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反總×106]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W

按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，3×10-4 L； V 樣：加入樣本體積，0.125 mL；V 樣總：加入提取液體積，

0.808 mL；T：反應(yīng)時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。

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