琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

琥珀酸脫氫酶試劑盒 三羧酸

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

SDH（EC 1.3.5.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。SDH 是線粒體的一種標(biāo)志酶，位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。此外，為多種原核細(xì)胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子。

測(cè)定原理：

SDH 催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下的氫通過吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳遞還原 2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在 600nm 處具有特征吸收峰，通過 600nm 吸光度的變化，測(cè)定 2．6-DPIP 的還原速度，代表SDH 酶活性。

組成：

試劑五：粉劑×1 支，4℃保存，臨用前加入 2ml 蒸餾水，用不完的試劑仍 4℃保存；試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 2ml 蒸餾水，用不完的試劑 4℃保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 SDH（此步可選做）。

在步驟④的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體SDH 活性測(cè)定。

測(cè)定步驟和加樣表：

37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃（其它物種）保溫 10min 左右

用蒸餾水調(diào)零后，依次加各試劑到 1 ml 玻璃比色皿中，在加入試劑六的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，混勻，在 600 nm

波長(zhǎng)下記錄 20 秒時(shí)的初始吸光度 A1 和 1 分 20 秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

SDH 活性的計(jì)算：

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。 SDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T=1508×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=304.6×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。 SDH 活性（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.609×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

琥珀酸脫氫酶試劑盒 三羧酸