己糖激酶(hexokinase，HK)試劑盒說明書

微量法 100 管/96樣

己糖激酶試劑盒 糖酵解

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

HK（EC 2.7.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是葡萄糖分解過程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交叉點(diǎn)。

測定原理：

HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化 6-磷酸葡萄糖脫氫生成 NADPH， NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

在試劑二中加入 18ml 試劑一充分溶解，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

在試劑三中加入 1ml 試劑一，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、10μl 試劑三和 180μl 試劑二，混勻，立即記錄 340nm處 20s 時(shí)的吸光值A(chǔ)1 和 5min20s 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意：不同勻漿組織中 HK 活力不一樣，做正式試驗(yàn)之前請做 1-2 只預(yù)試，若ΔA>0.5，則說明組織活力太高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），或縮短反應(yīng)時(shí)間至 2min,使ΔA<0.5，以提高檢測靈敏度。

HK 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下：

1、血清（漿）HK 活性

單位的定義：每毫升血清（漿）在每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=643×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 HK 活性

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=643×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=1.286×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下：

1、血清（漿）HK 活性

單位的定義：每毫升血清（漿）在每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=1286×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 HK 活性

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=2.572×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑， 0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

己糖激酶試劑盒 糖酵解