葡萄糖脫氫酶（Glucose dehydrogenase，GCDH）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

葡萄糖脫氫酶試劑盒 糖代謝

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

GCDH（EC 1.1.1.47）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，大量存在于高等動(dòng)物的肝臟和弱氧化醋桿菌中。在低聚果糖生產(chǎn)中使用GCDH，不僅能去除低聚果糖中的葡萄糖提高低聚果糖的含量，而且生成的葡萄糖酸與鈣離子結(jié)合生成的葡萄tang酸鈣是一種理想的補(bǔ)鈣制劑。因而，GCDH已成為制備高含量低聚果糖的理想用酶。

測(cè)定原理：

GCDH 催化D-葡萄糖和NAD 生成D-葡萄糖酸和NADH，在 340nm 下測(cè)定NADH 上升速率，即可反映GCDH 活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織的前處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的前處理：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零；

2、工作液的配制：臨用前將試劑二轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑 4℃可保存一周；

3、將工作液置于 37℃預(yù)熱 5 分鐘。

4、在 1ml 石英比色皿中加入 10μl 樣本和 190μl 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 1min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

GCDH 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=3215×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=6.43×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=6430×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=12.86×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.05cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

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