α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase, α-GAL）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/48 樣

α-半乳糖苷酶試劑盒 糖代謝

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

α-GAL (EC 3.2.1.22)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，能專(zhuān)一地催化α半乳糖苷鍵的水解，主要參與棉子糖、水蘇糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL 對(duì)于植物種子的萌發(fā)至關(guān)重要，種子萌發(fā)初期，其催化產(chǎn)生的 D-半乳糖通過(guò)糖酵解途徑迅速轉(zhuǎn)化和消耗，為種子的萌發(fā)提供最初的能量來(lái)源，后期則主要參與細(xì)胞壁儲(chǔ)藏多糖水解。

測(cè)定原理：

α-GAL 分解對(duì)-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成對(duì)-硝基苯fen，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算α-GAL 活性。

組成：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 2.5ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定（在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入 37℃保溫 30min

充分混勻， 400nm 處測(cè)定吸光值A，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

α-GAL 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.00585x -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/ml），y 為吸光值。

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯fen定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯fen定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GAL 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯fen定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GAL 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.08×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.07ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01ml；V 樣總：加入提取液體積， 1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間， 30min。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0039x -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/ml），y 為吸光值。

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯fen定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯fen定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GAL 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯fen定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GAL 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.12×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.07ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01ml；V 樣總：加入提取液體積， 1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間， 30min。

α-半乳糖苷酶試劑盒 糖代謝