脯an酸脫氫酶（ Proline dehydrogenase，ProDH)試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

脯an酸脫氫酶試劑盒 氨基酸

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

ProDH 是存在于線粒體內(nèi)的催化脯an酸降解的關鍵酶。脯an酸是分布zui廣泛的一種滲透物質(zhì)，在脅迫條件下很多植物可以通過增加合成、減少降解而在體內(nèi)累積大量脯an酸，降低 ProDH 活性對于調(diào)節(jié)滲透平衡、防止?jié)B透脅迫對植物造成傷害、清除自由基、保護細胞結構具有重要意義。

測定原理：

利用異liu氰酸甲酯檢測 ProDH 催化的脫氫反應，600nm 處吸光值的吸光值的變化反映酶活性的高低。

組成：

試劑三臨用前加入 8ml 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑 4℃保存；試劑四臨用前加入 8ml 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑 4℃保存；

自備儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿，1500g 4℃離心 15min，取上清液于一支新的 EP 管中，加入一滴試劑一（用 10μl 的槍頭加入），渦旋混勻，冰浴放置 30min 后，16000g 4℃離心 20min，取上清置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 600nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

混合液的配制：首先將試劑三和試劑四配成溶液（見試劑的組成和配制），臨用前根據(jù)用量按照試劑二（V）：試劑三（V）：試劑四（V）=7.2（ml）：0.9（ml）：0.9（ml）的比例充分混勻。（注意：現(xiàn)配現(xiàn)用，用多少配多少），置于 30℃水浴 5min；

試劑五的配制：取試劑五一支，臨用前加入 1ml 蒸餾水充分溶解待用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3）1ml 玻璃比色皿中加入 175μl 樣本、75μl 試劑五和 750μl 混合液，混勻，立即記錄 600nm 處初始吸光值A1 和 10min 后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

ProDH 活性計算：

按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每分鐘每 mg 組織蛋白在每ml 反應體系中使 600nm 處吸光值變化 0.01 為一個酶活力單位。

ProDH（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =57.14×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位定義：每分鐘每 g 組織在每ml 反應體系中使 600nm 處吸光值變化 0.01 為一個酶活力單位。

ProDH（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =57.14×ΔA÷W

V 反總：反應體系總體積，1ml； V 樣：加入樣本體積，0.175ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml； T：反應時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

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