NAD-蘋(píng)果酸酶（Malic enzyme，NAD-ME）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

NAD-蘋(píng)果酸酶試劑盒 輔酶Ⅱ

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

ME 廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME 催化蘋(píng)果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng)，是蘋(píng)果酸代謝的關(guān)鍵酶。 ME 活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來(lái)植物 ME 活性測(cè)定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專一性和對(duì)底物特異性的不同，可將ME 分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。

測(cè)定原理：

NAD-ME 催化NAD+還原成NADH，在 340nm 下測(cè)定NADH 增加速率。

組成：

試劑三：粉劑×1 支，4℃保存；用時(shí)加 2ml 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；用時(shí)加 1ml 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 石英比色皿和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞

（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一、二、三和四置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。如果一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

3、操作表：

將上述試劑按順序加入 1 ml 石英比色皿中，混勻，立即記錄 340 nm 波長(zhǎng)下初始吸光度A1 和反應(yīng) 1min

后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意：如果ΔA＜0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到 2 分鐘或 5 分鐘。

NAD-ME 活性計(jì)算：

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 4823×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T = 4823×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T =9.646×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.03 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

NAD-蘋(píng)果酸酶試劑盒 輔酶Ⅱ