輔酶ⅡNADP(H)含量測(cè)定試劑盒(分光光度法）

分光光度法

輔酶ⅡNADP(H)含量測(cè)定試劑盒分光光度法

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)第一個(gè)限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。

測(cè)定原理：

CS 催化乙酰CoA 和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔mei A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無(wú)色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在 412nm 處有特征吸光值。

組成：

CE009-25T/12S 試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 1.2ml 蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

CE009-50T/24S 試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 2.4ml 蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿、研缽、冰、無(wú)水乙醇和蒸餾水

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

稱(chēng)取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。將勻漿 600g，4℃離心 5min。

棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。

在步驟④的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3

秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體CS 測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

在試劑五中加入 0.6ml 無(wú)水乙醇和 13ml 試劑四，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

測(cè)定管：在EP 管中加入 40μl 樣本、880μl 試劑五和 40μl 試劑六，混勻，37℃反應(yīng) 15min 后立即測(cè)

定吸光值A(chǔ)1。

對(duì)照管：在EP 管中加入 40μl 樣本、880μl 試劑四和 40μl 試劑六，混勻，37℃反應(yīng) 15min 后立即測(cè)定吸光值A(chǔ)2。

計(jì)算ΔA=A1-A2，每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

CS 活性計(jì)算：

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。 CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=23.8×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.0475×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.6×10-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.04 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：樣本 蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

輔酶ⅡNADP(H)含量測(cè)定試劑盒分光光度法