葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

葡萄糖氧化酶試劑盒

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

GOD（EC 1.1.3.4）廣泛存在于動(dòng)物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并產(chǎn)生 H2O2，是生物體中產(chǎn)生活性氧的代謝途徑之一

測(cè)定原理：

GOD 催化產(chǎn)生H2O2，過氧化物酶催化 H2O2 氧化 4-氨基安替bi林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在 500 nm有特征吸收峰，顏色深淺與 GOD 活性成線性關(guān)系。

試劑的組成和配制：

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 20ml 緩沖液充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存一個(gè)月；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 20ml 緩沖液充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存一個(gè)月。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水。

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 500nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一和試劑二的配制：參見試劑的組成和配制。

3、煮沸樣本的準(zhǔn)備：取 500μl 樣本至新的EP 管中，95℃水浴 10min，冷卻至室溫后，8000g 4℃離心10min，取上清作為對(duì)照管的煮沸樣本待測(cè)。

4、測(cè)定操作表

混勻，35'C 保溫 15min 后，于 500nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度。ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

GOD 活力單位的計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 2.8348x - 0.0169；x 為H2O2 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/ml），y 為ΔA。

1、血清（漿）GOD 活力的計(jì)算

單位定義：每ml 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2 為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/ml）= (ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷V 樣÷T×1000=58.8×(ΔA+0.0169)

2、細(xì)菌、細(xì)胞或組織 GOD 活力的計(jì)算

按蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2 為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/mg prot）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷(V 樣×Cpr) ×1000÷T

=58.8×(ΔA+0.0169)÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2 為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/g 鮮重）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總) ×1000÷T

=58.8×(ΔA+0.0169)÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每一萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2 為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/104 cell）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總) ×1000÷T

=0.118×(ΔA+0.0169)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.625ml； V 樣：加入樣本體積，0.25ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml； T：反應(yīng)時(shí)間，15 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。 

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADPH (nmol/104 cell）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.003× (△A -0.0259）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05ml；V2：加入提取液體積，2ml；V3：加入血清（漿）體積：0.1ml； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

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