NobleRyder C9268 DH10BAC 感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品貨號(hào)：C9268

產(chǎn)品名稱：DH10BAC 感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格：20*100ul/10*100ul

DH10BAC 感受態(tài)細(xì)胞 載體構(gòu)建

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：-70℃

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyder C9268 DH10BAC 感受態(tài)細(xì)胞適用于昆蟲(chóng)桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)中同源重組的菌株，用于產(chǎn)生重組Bacmid。DH10Bac細(xì)胞包含親本BacmidbMON14272和輔助質(zhì)粒pMON7124 。親本Bacmid 包含一個(gè)mini-F 復(fù)制子、卡na霉素抗性基因、attTn7位點(diǎn)和lacZα-互補(bǔ)因子。輔助質(zhì)粒包含四huan素抗性和tnsABCD 區(qū)域，該區(qū)域提供了mini-Tn7從供體質(zhì)粒插入親本Bacmid 靶位點(diǎn)所需要的轉(zhuǎn)座蛋白。供體如 pFastBac 系列質(zhì)粒（pFastBac1，pFastBacDual等）含有Tn7R和Tn7L同源重組臂，Tn7R和Tn7L之間包含慶da霉素抗性基因、昆蟲(chóng)病毒多角體基因啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和SV40 病毒的 PolyA 加尾信號(hào)。當(dāng)含有靶基因 pFastBac 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 DH10Bac 細(xì)胞后，發(fā)生重組后就可產(chǎn)生重組Bacmid，提取純化重組Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9或Sf21就可以包裝產(chǎn)生昆蟲(chóng)病毒。此外，DH10Bac細(xì)胞中的Theφ80dlacZΔM15基因的產(chǎn)物可以實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶的α-互補(bǔ)現(xiàn)象，用于重組Bacmid的藍(lán)白斑篩選。大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞是經(jīng)特殊工藝制備，使用pUC19 質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)107cfu/μg。

基因型：

F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalKλ-rpsLnupG/pMON14272/pMON7124

操作方法：（以下操作均按無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）

1. 取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞懸液分裝到無(wú)菌預(yù)冷的離心管中，置于冰浴中。

2. 向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入1-10ng重組質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，在冰浴中靜置30分鐘。

3. 將離心管置于42℃水浴中放置90秒鐘，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2分鐘，該過(guò)程不要搖動(dòng)離心管。

4. 向每個(gè)離心管中加入900μL無(wú)菌的SOC（不含抗生素），混勻后置于37℃200rpm，搖床振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。

5. 用SOC培養(yǎng)基進(jìn)行10倍梯度稀釋，如分成3個(gè)稀釋梯度 10-1，10-2，10-3。

6. 取100μL 的各個(gè)梯度的培養(yǎng)物用于涂布。等平板中的液體wan全吸收后，倒置平板，37℃培養(yǎng) 24-48小時(shí)。

7. 保留剩余的菌液于4℃冰箱中，視平板上菌落生長(zhǎng)情況決定去留。

注意事項(xiàng)：

1．感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70℃，不可反復(fù)凍融，否則其轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低。

2．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止其它DNA或雜菌的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來(lái)影響。

3．轉(zhuǎn)化時(shí)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA量過(guò)多或體積過(guò)大反而會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)DNA體積要小于感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一。

4．轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA總量。

5．為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到最di。

DH10BAC 感受態(tài)細(xì)胞 載體構(gòu)建 

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C9268 DH10BAC 感受態(tài)細(xì)胞  20*100ul/10*100ul