諾博萊德 DAB法顯色試劑盒 顯色與信號(hào)檢測(cè)

NobleRyder  SW9828  DAB法顯色試劑盒（小鼠/兔IgG）,Western Blotting Mouse/Rabbit IgG DAB Chromogenic Reagent Kit

產(chǎn)品貨號(hào)：SW9828

產(chǎn)品名稱：DAB法顯色試劑盒（小鼠/兔IgG）,Western Blotting Mouse/Rabbit IgG DAB Chromogenic Reagent Kit

產(chǎn)品規(guī)格：1盒

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

英文名稱：Western Blotting Mouse/Rabbit IgG DAB Chromogenic Reagent Kit

中文名稱：DAB法顯色試劑盒（小鼠/兔IgG）

規(guī)格：1盒

儲(chǔ)存條件：-20℃，avoid light，1 year

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

保存：

-20℃避光密閉保存，一年有效。若經(jīng)常使用，可將封閉試劑，抗體稀釋液和 20 倍 DAB 顯色液B 存放于 2-8℃以方便使用。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

SDS-PAGE電泳后，蛋白質(zhì)按照分子量大小分離，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）后， 固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免 疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色以檢測(cè)電泳分離的特異性的蛋白。

操作步驟：(僅供參考)

常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后:

1) 清洗轉(zhuǎn)印膜：將膜剝離下后，作好標(biāo)記，一般在左上角剪一缺口。室溫用 TBS-T 漂洗 3 次每次 5min, 以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的 SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。

2) 按 5g 封閉試劑加 100ml 雙蒸水計(jì)，配制膜封閉液，配好的膜封閉液為乳白色懸液，將漂洗過(guò)的轉(zhuǎn)印膜，封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng)，室溫封閉 30min。用 TBS-T ，PH7.6 洗液，室溫漂洗 3 次每次 5min。

3) 將 10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成 1×（10ml 10×抗體稀釋液加入 90ml 雙蒸水，混勻，可 4℃ 保存三個(gè)月）。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。

4) 用 1×的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量以及一抗的推薦稀釋濃度來(lái)稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育過(guò)夜或 37℃搖動(dòng)孵育 2h。此用過(guò)的抗體一般可回收第二天再使用一次。

注：如果所加一抗不同，可在此步將膜沿電泳方向剪成條，分別作好標(biāo)記，分開(kāi)孵育。

5) 用 TBS-T，PH7.6 洗液，室溫漂洗 3 次每次 5min。

6) 用稀釋好的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量，按 10ml 抗體稀釋液加入 1-2ul HRP 標(biāo)記二抗的比例， 配制二抗工作液。將雜交膜放入雜交袋中，加入二抗工作液，封口，37℃搖動(dòng)孵育 1h。此用過(guò)的抗體一般可回收第二天再使用一次。

7) 用 TBS-T ，PH7.6 洗液，室溫漂洗3次每次 10min。

8) 配制 DAB 顯色：根據(jù)用量，取 TBS-T 4ml，加入 DAB 顯色液 A、DAB 顯色液 B 各 200ul，混勻，加 在膜正面，室溫下顯色。在目標(biāo)條帶顯出后，而且背景未出時(shí)，放入水中終止顯色。

注意事項(xiàng)：

1. 請(qǐng)根據(jù)一抗來(lái)源選擇試劑盒。

2. western blotting DAB 顯色法操作簡(jiǎn)單，但其敏感性與 ECL 發(fā)光發(fā)有一定的差距，一般只適用于豐度較高的蛋白。

3. 可以根據(jù)顯色結(jié)果來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間。如背景過(guò)深，可延長(zhǎng)膜封閉時(shí)間，加長(zhǎng)最終漂洗次數(shù)與時(shí)間。如果條帶過(guò)弱，可延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間。

4. 如果wan全沒(méi)有條帶，請(qǐng)檢查前期蛋白處理及實(shí)驗(yàn)過(guò)程， 如果確認(rèn)無(wú)誤，反復(fù)兩次依舊無(wú)結(jié)果， 請(qǐng)換用 ECL 發(fā)光法顯色。

5. TBS-T（0.01M）配制方法：稱取 NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用 800ml 的雙蒸水溶解，用鹽酸調(diào) PH 到 7.6，再加入 0.5ml Tween－20，用雙蒸水 加至 1000ml，混勻即可。（也可按照自己的配制習(xí)慣來(lái)配制）

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